1.質粒問題

　　制備不當的DNA樣品、純度差或殘留酶切污染（抑制物）。雜蛋白存在會影響酶切，表現為A260/A280低于1.8；抑制物常見酚、乙醇、蛋白質、EDTA、SDS、高鹽等。

　　A260/A280是在測量DNA、RNA提純后的純度的，如果有蛋白質污染，這個比值就比較小。因為蛋白質在280處有吸收值。高純度的DNA、RNA這個比值應該在1.8-2左右。

　　2.酶的問題

　　確認內切酶有效（很多內切酶雖然有過期時間，但過期后只要能夠有效酶切，可用。確認酶切效果不好，做標記，更換）。

　　3.buffer問題

　　有些酶切的buffer中，添加了一些較為容易析出或溶解的成分，有時酶切的buffer沒有*融化時，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時間后，融化部分的離子濃度會變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對離子濃度敏感的內切酶時就會出現問題。

　　4.雙酶切的buffer選擇

　　確認使用的是正確的buffer和反應溫度。

　　5.酶切位點的甲基化影響

　　限制性內切酶不能切割甲基化的識別序列。常見的有Xba I、Bcl I等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。大腸桿菌等原核生物具有限制－修飾系統，Dam、Dcm常使DNA樣品甲基化而不被切割。如果是直接從哺乳動物細胞中提取的DNA，則部分DNA會因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點被甲基化后，酶切會受影響。因此，出現酶切不開或不全時需要考慮甲基化的問題。